Non-category （寄稿・挨拶・随想・その他） 非臨床アレルゲン性試験の現状と課題 澤田　純一 （独立行政法人医薬品医療機器総合機構） １．はじめに 　本稿は、第17回日本免疫毒性学会学術大会（つくば市、平成22年９月10日）の教育講演の内容をまとめたものである。 　広義の免疫毒性には、免疫抑制の他に、免疫機能亢進、アレルギー亢進、自己免疫誘導、偽アレルギー誘起等、薬物非特異的に免疫系の機能変化をもたらすもの、薬物特異的な免疫毒性である薬物アレルギーや薬物特異的自己免疫も含まれる。本稿では、薬物特異的な免疫毒性である薬物アレルギーを中心に解説したい。 　化学物質やタンパク質の中には、アレルギーを誘発するものが数多く知られているが、そのようなアレルギー誘発物質はアレルゲン（allergen）と、また、アレルギーを誘発する性質はアレルゲン性（allergenicity）と呼ばれる。アレルゲン性とは、生体にとって有害な性質として用いられるが、単に免疫応答を誘導するという意味で用いられる場合や、生体にとって有利に働く（異物排除のための免疫応答を誘導する）場合には、免疫原性（immunogenicity）と云う言葉が用いられることが多い（例えば、ワクチンや治療用タンパク質医薬品の免疫原性）。 　代表的なアレルギーには、IgE等の抗体産生に起因する即時型アレルギーと、遅延型過敏症のような細胞性免疫に起因する遅延型アレルギーがあるが、両者の発症機構は大きく異なる。アレルギーに類似した症状を示すが、抗原特異的なものでないものは、偽アレルギー（pseudoallergy）と総称して呼ばれ、アスピリン喘息、抗原非特異的なヒスタミン遊離反応、抗原抗体反応に基づかない補体の活性化等が含まれるが、本稿では取り扱わない。 　遅延型のアレルギーには、固定薬疹、ウイルス再活性化の関与が示唆されているDIHS（drug-induced hypersensitivity syndrome）、重症薬疹（Stevens-Johnson syndromeやtoxic epidermal necrosis）と呼ばれるものがあるが、発症機序が未解明な部分も多く、非臨床のアレルゲン性試験では予測対象として想定されていない。 　かなりの数の薬物が自己免疫を誘導することが知られており、薬物特異性（または薬物依存性）が明確になっているものと、薬物非特異的に自己免疫を誘導するものの２つのタイプが知られている。薬物により誘起される自己免疫が、時として重篤な副作用となることもあるが、発症機序や病態の分類が明確でないこともあり、これらの副作用の非臨床試験による予測は、次の課題として残されている。 　また、低分子物質とタンパク質によるアレルギーには、発症機構の相違に加えて、暴露経路による発症部位の相違も認められる。従って、以下は、アレルゲンの種類とアレルギーのタイプに分けて、非臨床アレルゲン性試験法の背景、現状、課題を紹介してゆきたい。なお、本稿は、著者の個人的見解であり、所属する組織の見解ではない。 ２．化学物質による遅延型アレルギーの予測（皮膚感作性試験） 　化学物質による遅延型アレルギーとしては、接触過敏症が代表的なものとなる。アレルゲン（ハプテン）が皮膚を通過して、何らかの形で皮膚の樹状細胞であるランゲルハンス細胞が活性化し、所属リンパ節に遊走する。そこで、アレルゲン（ハプテン）に特異的に反応するT細胞に抗原提示を行い、その結果、T細胞が活性化・増殖し、感作T細胞として末梢に循環するといわれている。再度、アレルゲンが侵入すると、抗原提示細胞（ランンゲルハンス細胞）のHLAとハプテン化されたペプチドを感作T細胞が認識し、局所的な皮膚反応を誘起する。特異的なT細胞の増殖の過程は「感作」と、２回目以降のアレルゲンの侵入で感作Ｔ細胞やマクロファージを巻き込んだ皮膚反応が起きることは「惹起」と呼ばれている。 　体内に入った化学物質が抗原提示細胞より提示される場合、通常は、ペプチドに薬物が結合した形でHLA分子上に結合し、ペプチド-HLA複合体をＴ細胞受容体（TCR）が認識するものと予想されているが、実際には、必ずしも共有結合を介さない場合がある。そのようなケースでは、HLA、化学物質、TCRの三者の非共有結合の複合体ができるため、p-i（ pharmacological interaction） conceptとして説明されている1）。重金属の場合にも、これに似ており、配位結合を介するとされる。 　遅延型アレルギー、特に、接触過敏症の予知試験法としては、皮膚感作性試験が用いられている。古くは、モルモットを用いる試験法が主流であり、化学物質に関しては、OECD406ガイドラインが、医薬品に関しては、皮膚感作性試験のガイドラインが既に設定されている。欧米では、Guinea pig maximization test（ GPMT法）及びBuhler法が主に用いられていた。GPMT法では、感作にアジュバントや界面活性剤などを用い、Buhler法では閉鎖パッチを用いる。 　近年、皮膚感作性試験法として、マウスを用いるLocal lymph node assay（ LLNA）が広く用いられるようになっている。本法は、ICCVAM（Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods ）等によりによりバリデートされ、GPMT法に劣らないと評価されたものである2）。本法は、OECDの試験法ガイドライン429として収載され、EMAやFDAにより皮膚感作性試験法として認められている。LLNAは、所属リンパ節でのリンパ球の増殖をみる方法で、感作の過程を反映する。LLNAは、耳介塗布（３日連続）により感作を行い、６日目の所属リンパ節におけるリンパ球の分裂を指標とする。本法は、GPMTに較べてより簡便であり、所要期間も短くてすみ、必要なコストも低い。また、皮膚刺激を有する被験物質に使える点でも優れている。 　LLNAは、放射性チミジン（または、ヨウ化デオキシウリジン）を静注する方法であり、この点で使いにくいとの欠点があった。最近、LLNA法は日米欧の代替法にする委員会によりアップデートされ、動物数を減少できる場合や、類似の変法をバリデートする際の考え方やリファレンス化合物のリストなどが追加され、OECDガイドライン429の改訂版3）にも反映されている。また、放射性物質を使わない変法、LLNA-DA法、LLNA-BrdUELISA 法も代替法として認められた。現在は、これらの内容はOECDガイドライン442A4）、442B5）として収載されるに至っている。 　本邦の医薬品の非臨床ガイドラインでは、従前の方法、Maximization Test法、Buehler Test法、Adjuvant and Patch Test法、Draize Test法、Freund's Complete Adjuvant Test法、Open Epicutaneous Test法、Optimization Test法、Split Adjuvant Test法が例示されており、例示した試験法以外のものを用いる場合には、その妥当性を示せばよいとされている。国際的に認知されているLLNA法に関しては、ガイドラインでの明示が望ましいが、LLNA法の使用を許容するために、最近改訂された「医薬品非臨床試験ガイドライン解説2010」において、LLNAに関する補足説明が追加されている6）。 　ヨーロッパでは、動物愛護の観点から、化学物質の安全性評価に用いる実験動物数の削減が要請されており、動物を用いないインビトロ及びインシリコの予測法の開発が喫緊の課題とされている。皮膚感作性物質によく見られる性質として、化合物またはその代謝物の反応性、皮膚透過性があるが、このような性質を利用して、インシリコで予測する方法やペプチドとの反応性をみる化学的方法が提唱されている7）。また、抗原提示細胞の活性化を見るhCLAT法7,8）やMUSST法7）が代替法として検討されている。最近では、T細胞の活性化を含めたインビトロ系の開発が進められている9）。 ３．化学物質による即時型アレルギー 　ICH S8 ガイドライン（医薬品の免疫毒性試験に関するガイドライン）の序文に、「現在、医薬品の全身または呼吸器系におけるアレルゲン性（抗原性）や薬物特異的な自己免疫を評価する標準的な試験方法はなく、これらを評価する試験は三極のいずれにおいても要求されていない。」と述べられているように、現在、低分子化学物質を対象にして即時型のアレルゲン性を予測しうる非臨床試験法としてバリデートされたものはない。かつて、厚生省（当時）から抗原性試験ガイドライン（案）が提示され、化合物原体や原体-抗原付加体をアジュバントとともに感作に用い、化合物原体や原体-抗原付加体をアナフィラキシー惹起に用いる試験（抗原性試験）が用いられたこともあった。しかし、これらの試験系はモデル系としては有用であるが、ヒトでのアレルゲン性を予測する能力が低いことが示されており10,11）、現在は推奨されていない。 　低分子による�T〜�V型のアレルギー発症には、古くから云われているように、代謝活性化された低分子化合物とタンパク質との付加体が生成される必要があると考えられている。多くの場合、生じた付加体のハプテン部分が、B細胞受容体（sIg）や抗体によりＢ細胞エピトープとして認識されるものと考えられる。�T型のアナフィラキシー反応には、ヒト及びマウスの場合にはIgEクラス、モルモットの場合にはIgG1及びIgEクラスの抗体が主として関与する。 　このようなアレルギー誘発性の薬物特異的抗体の産生に関係する因子としては、暴露経路、代謝系（チトクロームP450酵素等の酸化酵素、アセチル転移酵素、グルタチオン転移酵素、グルクロン酸転移酵素、等）による活性化または不活性化、抗原提示細胞（樹状細胞やマクロファージ）による取り込み（トランスポーター、TLRs）、TAP、 HLA class IおよびII、ペプチド生成に関与する酵素の基質特異性、T細胞（helper T cells、effector T cells、regulatory T cells）のTCRレパートリー、B細胞の抗体（VH and VL）のレパートリー、クラススイッチ等が考えられる。動物を用いる即時型アレルギー試験の予知能力が低い原因としては、特に、代謝活性化に関与する酵素、MHC分子、T細胞受容体レパートリー、抗体レパートリー等の種差の関与が考えられる。 　抗体産生に必要とされるヘルパーT細胞がどのようにして誘導されるかに関しての情報は意外に少ない。通常、化学物質が結合するタンパク自身は、自己抗原であるため、自己反応性T細胞もしくはハプテン（ハプテン化された自己ペプチド）特異的T細胞がヘルパーT細胞として働く筈であるが、この点は明瞭にされていない。ハプテン化T細胞エピトープの生成において、ハプテン化が、細胞内または細胞外のいずれで生じるのか等の疑問も解決されていない。さらに、ハプテン特異的B細胞が認識するハプテン化タンパク質の実体や、その生成機構に関する情報も極めて少ない。 ４．食品添加物のアレルゲン性 　最近、食品安全委員会で「食品添加物の食品健康影響評価指針」12）が決定されている。そのアレルゲン性試験では、「化学物質を経口的に摂取した場合のアレルギー誘発能を予測する方法は十分に確立されておらず、特に、即時型アレルギーの誘発性を予測し得る方法は未確立であるが、添加物に係る知見、使用形態等を考慮した上で、専門家が適切と判断した感作及び惹起方法で試験を実施するべきである。当面は、少なくとも遅延型アレルギーを指標とするアレルゲン性試験を実施する必要があるが、モルモットを用いた皮膚感作性試験（例：OECD テストガイドライン406のうちマキシミゼーション試験（GPMT））又はマウスを用いたリンパ節反応試験（例：OECD テストガイドライン429（局所リンパ節試験（LLNA）））を利用することができる。」と記載されている。 　なお、「タンパク質を構成成分とする添加物のアレルゲン性の評価については、「遺伝子組換え食品（微生物）の安全性評価基準に準じて行うこととする。」とされている（次項参照）。 ５．タンパク質のアレルゲン性試験法（食物アレルギー） 　「アレルギー物質を含む食品に関する表示（平成20年厚生労働省令112号、平成20年６月３日）」において、表示義務のあるものとして、７品目（えび、かに、卵（鶏、あひる、うずら）、小麦、そば、落花生、乳（牛乳））、表示が推奨されるものとして、18品目（あわび、いか、いくら（すじこ）、さけ、さば、オレンジ、キウイフルーツ、バナナ、もも、りんご、大豆、くるみ、やまいも、まつたけ、牛肉、鶏肉、豚肉、ゼラチン）が指定されている。これらのアレルゲンが含まれる食品に関しては、表示の問題を含め、適切なリスク管理が必要とされる。 　一方、食物に含まれる新規タンパク質のアレルゲン性の予知は、難しい問題を含んでいるが、現在、国際的にも認知されている方法は、遺伝子組換え食品の安全性評価において用いられている方法である13,14）。そこでは、組換えタンパク質自体とその供与核酸の起源となる生物のアレルゲン性に関する情報、当該タンパク質の物理化学的な安定性（加熱や胃液（ペプシン）･腸液（トリプシン、キモトリプシン）に対する安定性）、既知のアレルゲン（とB細胞エピトープ）との構造の類似性が考慮され、アレルゲン性が疑われる場合には、アレルギー患者血清のIgE抗体との交差反応性が試験される。さらに、懸念が残る場合には、ヒトでのアレルゲン性試験が要求されている。 　現在知られている主な食物アレルゲンとしては、parvalbumins、caseins、β-lactoglobulin（ lipocalin family）、α-lactalbumin、α-amylase inhibitor （prolamin superfamily）、trypsin inhibitor（ prolamin superfamily）、plant lipid-transfer proteins（ LTPs） （prolamin superfamily）、Bet v 1-homologous proteins、 thaumatin-like proteins（ TLPs）（ prolamin superfamily）、 2S albumins（ prolamin superfamily）、7S seed storage globulins、11S seed storage globulins、fruit class I chitinases（ cross-reactive with hevein）、等があり、比較的限られたファミリーに属するタンパク質が食物アレルゲンになりやすいことが知られている。また、食物アレルゲンには、摂取量が多い、消化性が悪い、熱安定性が高い、糖鎖を有する、繰り返し構造をもつ、凝集しやすい、等の性質があるものが多い。組換え食品のアレルゲン性予知法に関する多くのガイドラインは、このような性質を念頭において作成されたものである。 　既知アレルゲンとの構造類似性（ FAO/WHO 2001& Codex 2003）では、80以上のアミノ酸よりなるペプチドの相同性が35%以上か（既知の主要アレルゲンが、限られたグループに属することが多いため）、６〜８連続アミノ酸配列が既知アレルゲンと一致しないか否か（B細胞エピトープになりやすいか否か）が検討される。問題点としては、偽陽性が出やすいことがあり、アレルギー患者IgEとの結合試験（交差反応性）による確認が必要とされる場合がある。また、未知のアレルゲン、不連続エピトープ、糖鎖エピトープは予測できない。 　インシリコ予知法の改良の試みとして、いくつかの方法論が提案されているが、B細胞エピトープ予測率は未だ不十分であるのが現状である。T細胞エピトープの予測に関しては、次項で述べたい。 ６．治療用タンパク質の免疫原性 　現在、遺伝子組換え技術を利用して、多数の治療用タンパク質が製造・市販されているが、天然型のタンパク質と同じアミノ酸配列を有するにもかかわらず、投与患者で抗体が産生されることが知られている。多くの場合、産生される抗体が有効性・安全性に大きな影響を及ぼすことは少ないとされているが、中和抗体による有効成分濃度の低下に伴って、薬効低下がもたらされることもありうる。また、抗体がヒト体内に元来ある内在性の天然型タンパク質も中和してしまう場合には、重篤な副作用をもたらすこともある15）。しかし、このような重篤な副作用は市販後に初めて報告される場合が多く、事前の予知が難しいことが多い。一方、組換えタンパク質医薬品に対する細胞性免疫は、異種タンパク質を除いては報告がない。 　中和抗体の産生による有害事象は、異種タンパク以外に、epoetin alfa（ Eprexによる赤芽球癆）、PEG化MGDF（抗TPO IgG抗体による血小板減少症）、interferon-β1（多発性硬化症患者へのBetaseronやRebifの長期投与後の薬効低下）、第VIII因子（天然型および遺伝子組換えタンパク質の両者でみられる）、キメラ抗体などで報告されている。特に、遺伝的に欠損しているタンパクの補充療法において、治療用タンパクに対する免疫寛容が成立していない場合には、重篤な副作用が起きやすいといわれている。糖タンパク質の場合には、ヒトで生合成されないシアル酸であるN -グリコリルノイラミン酸に対して抗体が産生されることも知られている16）。また、アナフィラキシーとしては、異種タンパクの他にも、Galα1,3Gal糖鎖に対するIgE抗体による発症例が報告されている17）。 　治療用タンパク質に対する抗体産生が起こる頻度に影響する因子としては、患者の遺伝的背景、投与経路、投与期間の他に、宿主細胞の相違（大腸菌、動物細胞、昆虫細胞、酵母等）、蛋白質の構造（キメラ抗体や融合タンパク質）、アミノ酸配列の変異（アロタイプ）、翻訳後修飾（切断、グリコシル化、酸化、脱アミド化、糖付加、isomerization、非還元型のcysteine、等）、化学的な修飾やconjugation（ PEG化等）、剤型、保存状態（温度）、容器の材質やコーティング、添加物や不純物によるアジュバント作用、タンパク質の変性や凝集、等があることが報告されている。 　近年、バイオインフォーマティクス的手法を取り入れたT細胞エピトープの予測法が多数提唱されている。特に、MHC class I-結合性ペプチドの予測が先行してなされ、続いて、MHC class II-結合性ペプチドの予測もなされるようになった。HLA分子と結合しうるT細胞エピトープの予測は進みつつあるものの、低頻度のHLA型に関しては、まだ情報が不足している。一方、B細胞エピトープの予測は、既知のB細胞エピトープとのアミノ酸配列の類似性を調べる他によい手立てがないのが現状である18）。 ７．おわりに 　現在、非臨床のアレルゲン性試験法で完全なものはない。最終的には、ヒトでの疫学的データによる確認が重要とされる。アレルゲン性が予想される物質の使用に関しては、リスク・ベニフィットの観点から総合的に判断されるものと考えられるが、その使用に際しては、充分なリスク管理が必要とされる。 参考文献 1) Posadas SJ and Pichler WJ.:Delayed drug hypersensitivity reactions - new concepts. Clin. Exp. Allergy, 37: 989-399, 2007. 2) Dean JH, et al.:ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay. Conclusion and recommendations of an independent scientific peer review panel. Regul. Toxicol. Pharmacol., 34: 258-273, 2001. 3) OECD Guideline 429: OECD Guideline for the Testing of Chemicals. Skin Sensitization: Local Lymph Node Assay. http://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-429-skin-sensitisation_9789264071100-en 4) OECD Guideline 442A: OECD Guideline for the testing of chemicals. Skin Sensitization: Local Lymph Node Assay：DA .http://www.oecd-ilibrar y.org/environment/test-no-442a-skinsensitization_9789264090972-en 5) OECD Guideline 442B: OECD Guideline for the testing of chemicals. Skin ensitization: Local Lymph Node Assay： BrdU-ELISA. http://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-442b-skinsensitization_9789264090996-en 6) 医薬品非臨床ガイドライン解説2010. 2-7 皮膚感作性試験, 薬事日報社, 2010 7) Aeby P, et al.: Identifying and characterizing chemical skin sensitizers without animal testing: Colipa's research and method development program. Toxicol. In Vitro. 24: 1465-1473, 2010. 8) Sakaguchi H, et al.: Predicting skin sensitization potential and inter-laboratory reproducibility of a human Cell Line Activation Test（ h-CLAT） in the European Cosmetics Association（ COLIPA） ring trials. Toxicol. In Vitro. 24: 1810-1820, 2010. 9) Martin SF, et al.: T-cell recognition of chemicals, protein allergens and drugs:towards the development of in vitro assays. Cell. Mol. Life Sci., 67: 4171-4184, 2010. 10) 澤田純一、手島玲子：医薬品等の非臨床アレルゲン性試験とその問題. アレルギーの臨床, 20：104-110,2000. 11) Weaver JL , et al.:Detection of systemic hypersensitivity to drugs using standard guinea pig assays. Toxicology, 193: 203-217, 2003. 12) 食品安全委員会：添加物に関する食品健康影響評価指針（平成22年５月27日決定） 13) Codex Alimentarius Guideline(GL45-2003): Guideline for the conduct of food safety assessment of foods derived from recombinant-DNA plants. Annex 1. Assessment of possible allergenicity. 14) 食品安全委員会：遺伝子組換え食品（種子植物）の安全性評価基準（平成16年１月29日決定）；遺伝子組換え食品（微生物）の安全性評価基準（（平成20年６月26日決定）」） 15) 新見伸吾、他: 治療用タンパク質の免疫原性 その1.医薬品研究, 40：703-715, 2009. 16) Ghaderi D, et al.: Implications of the presence of N-glycolylneuraminic acid in recombinant therapeutic glycoproteins. Nat. Biotechnol., 28: 863-867, 2010. 17) Chung CH, et al.: Cetuximab-induced anaphylaxis and IgE specific for galactose-α-1,3-galactose. N. Engl. J. Med., 358: 1109-1117, 2008. 18) 新見伸吾、他：治療用タンパク質の免疫原性 その２.医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス, 41：390,2010.